Wir empfehlen: New England Biolabs Monarch® Spin gDNA Extraction Kit, QIAGEN Genomic-tip-500/G, QIAGEN MagAttract HMW DNA Kit, QIAGEN Puregene Yeast/Bacteria Kit. Im Allgemeinen können alle Extraktionsmethoden verwendet werden, die die Erzeugung von HMW gDNA ermöglichen und die oben genannten Anforderungen erfüllen. Um sicherzustellen, dass HMW DNA extrahiert wird, empfehlen wir:
- Waschen Sie die Bakterienzellpellets vor der DNA-Extraktion mit PBS, um potenzielle Inhibitoren zu entfernen.
- Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwerfen Sie den Überstand.
- Vermeiden Sie Vortexen und schnelles oder unnötiges Pipettieren; verwenden Sie nur Weithals-Spitzen.
- Eluieren Sie in nukleasefreiem Elutionspuffer, nicht in Wasser.
- Vermeiden Sie das Übertrocknen der gDNA.
- Setzen Sie die DNA nicht hohen Temperaturen (>37°C) für >1 Stunde aus.
- Verwenden Sie Puffer mit einem geeigneten pH-Wert von 7,5-8,5.
- Vermeiden Sie interkalierende fluoreszierende Farbstoffe oder UV-Strahlung.
- Vermeiden Sie Gefrier-Tau-Zyklen; lagern Sie gDNA bei 4°C für 1-2 Monate.
Kurze DNA-Fragmente sind typischerweise nicht ideal für Long-Read-Sequenzierungen, da sie zu einer schlechten Assemblierungsqualität führen können. Wir empfehlen, dass mindestens 50% der DNA länger als 15 kb sind. Um die Sequenzierungsergebnisse zu verbessern, empfehlen wir, kürzere DNA-Fragmente vor der Einreichung aus Ihrer Probe zu entfernen. Ein effektives Protokoll beinhaltet die Verwendung von 4-fach verdünnten SPRISelect-Perlen (35% Volumen/Volumen), um Fragmente kleiner als 3-4 kb zu eliminieren.
Bitte beachten Sie, dass die DNA-Menge nach diesem Prozess abnimmt, daher ist es wichtig, die verbleibende DNA zu quantifizieren, um sicherzustellen, dass genügend Material für die Sequenzierung vorhanden ist.
- Übertragen Sie jede Probe in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind-Röhrchen.
- Verdünnen Sie SPRISelect-Beads mit Elutionspuffer auf 35% (Volumen/Volumen).
- Resuspendieren Sie die verdünnten SPRISelect-Beads durch Vortexen.
- Fügen Sie 4-faches Volumen der resuspendierten verdünnten SPRISelect-Beads zu jeder gDNA hinzu und mischen Sie durch Schwenken des Röhrchens.
- Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie ausreichend frisches 80% EtOH in nukleasefreiem Wasser für alle Ihre Proben vor.
- Zentrifugieren Sie die Proben und pelletieren Sie die Perlen auf einem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist. Halten Sie die Röhrchen auf dem Magneten und pipettieren Sie den Überstand ab.
- Halten Sie das Röhrchen auf dem Magneten und waschen Sie die Beads mit frisch zubereitetem 80% EtOH, ohne das Pellet zu stören. Das EtOH-Volumen muss ausreichen, um die Beads vollständig zu bedecken. Entfernen Sie das EtOH mit einer Pipette und verwerfen Sie es.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
- Zentrifugieren Sie kurz und stellen Sie die Röhrchen zurück auf den Magneten, damit die Beads pelletieren. Pipettieren Sie das restliche EtOH ab. Lassen Sie es 30 Sekunden trocknen, aber trocknen Sie die Pellets nicht bis zum Reißen.
- Entfernen Sie die Röhrchen vom Magnetständer und resuspendieren Sie das Pellet in z.B. 50 µL nukleasefreiem 1xTE oder EB. Zentrifugieren Sie und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37°C mit sanfter Agitation (700 U/min) auf einem Schüttler.
- Pelletieren Sie die Perlen auf einem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist.
- Entfernen und behalten Sie das Eluat in sauberen 1,5 ml Eppendorf Safe Lock Tubes™.
Alternativ empfehlen wir die DNA-Reinigung und Größenselektion für Long-Read-Sequenzierungen von Jones et al. 2021 (Jones A, Torkel C, Stanley D, Nasim J, Borevitz J, et al. (2021) High-molecular weight DNA extraction, clean-up and size selection for long-read sequencing. PLOS ONE 16(7): e0253830. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253830; https://www.protocols.io/view/dna-clean-up-and-size-selection-for-long-read-sequ-261ge6ymol47/v4).
Reinheit:
Phenol, Chloroform und andere verwandte Reagenzien hemmen die Bibliotheksvorbereitung und müssen vollständig entfernt werden. Obwohl spektrophotometrische Messungen möglicherweise nicht alle Arten von Verunreinigungen erkennen, empfehlen wir dringend, diese durchzuführen, um die Probenreinheit zu bewerten. Idealerweise sollte das 260/280-Verhältnis über 1,8 liegen und das 260/230-Verhältnis zwischen 2,0 und 2,2 liegen. Wenn die Probe kontaminiert ist und diese Metrik nicht erfüllt, extrahieren Sie die Probe entweder erneut oder reinigen Sie die Probe, um die Verunreinigungen mit einem Qiagen-Reinigungskit oder AMPure XP-Perlen zu entfernen. Die Probe darf kein RNA enthalten; wir empfehlen dringend eine RNase-Behandlung während der Extraktion.
- Darf keine Denaturierungsmittel (Guanidiniumsalze, Phenol usw.) oder Detergenzien (SDS, Triton-X100 usw.) enthalten.
- Darf keine Restverunreinigungen vom Organismus/Gewebe (Häm, Huminsäure, Polyphenole usw.) enthalten.
- Darf kein unlösliches Material enthalten oder gefärbt oder trüb sein.