Da ribosomale RNA (rRNA) den Großteil einer Gesamt-RNA-Probe ausmacht, empfehlen wir, sie zu entfernen, um die Probe für andere RNA-Typen anzureichern. Dies kann entweder durch eine Poly-A-Selektion oder eine rRNA-Depletion erreicht werden, beide Methoden helfen, die Analyse auf informativere RNA-Populationen zu konzentrieren.

RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Transkriptomanalyse, und die Wahl zwischen PolyA-Anreicherung und rRNA-Depletion hängt von den spezifischen Zielen des Experiments und den Arten von RNA ab, die Sie untersuchen möchten. Hier ist eine Übersicht, wann jede Methode sinnvoll ist:

1. PolyA-Anreicherung

PolyA-Anreicherung isoliert selektiv mRNA, indem sie an die PolyA-Schwänze bindet, die am 3'-Ende der meisten eukaryotischen mRNAs zu finden sind. Dies ist nützlich, wenn Sie hauptsächlich an kodierender RNA (mRNA) interessiert sind, und vereinfacht die Analyse, indem die Komplexität der Probe reduziert wird.

Wann sollte man PolyA-Anreicherung verwenden?

• Fokus auf mRNA: Wenn Ihr Ziel darin besteht, protein-kodierende Gene zu analysieren, ist die PolyA-Anreicherung ideal, da sie die meisten mRNAs mit einem PolyA-Schwanz erfasst (was den Großteil des Transkriptoms in eukaryotischen Zellen ausmacht).
• Eukaryotische Proben: Die meisten eukaryotischen mRNAs haben PolyA-Schwänze, was die PolyA-Anreicherung besonders nützlich für diese Spezies macht.
• Reduzierung der rRNA-Interferenz: In RNA-Proben mit hohem rRNA-Gehalt hilft die PolyA-Anreicherung, die rRNA-Kontamination zu reduzieren, indem sie selektiv mRNA anreichert, obwohl sie rRNA nicht vollständig entfernt.
• mRNA-Profilierung: Wenn Sie Transkriptomik durchführen, um Genexpressionsniveaus oder alternatives Spleißen in kodierenden Regionen zu verstehen, ist die PolyA-Anreicherung effektiv.

Einschränkungen:

• Nicht-polyadenylierte RNAs: Sie erfasst keine nicht-polyadenylierten RNA, wie lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), miRNAs, rRNAs und einige kleine RNAs.

Überlegungen für minderwertige RNA (PolyA-Anreicherung):

• Reduzierte mRNA-Erfassung: Wenn die mRNA fragmentiert oder degradiert ist, erfasst die PolyA-Anreicherung hauptsächlich das 3'-Ende der mRNA, und es könnte zu einem Verlust wichtiger Daten kommen. Dies ist oft der Fall bei RNA, die aus FFPE-Schnitten extrahiert wurde.
• Moderate Degradation: Die PolyA-Anreicherung kann immer noch nützlich sein, wenn die RNA-Degradation moderat ist (d.h. nicht stark fragmentiert), solange eine ausreichende Menge intakter polyadenylierter RNA vorhanden ist.

2. rRNA-Depletion

Die rRNA-Depletion entfernt den Großteil der ribosomalen RNA (rRNA), die 80-90% der Gesamt-RNA in den meisten eukaryotischen Zellen ausmacht. Durch die Depletion der rRNA können Sie andere RNA-Typen analysieren, die weniger häufig vorkommen, wie mRNA (in Fällen, in denen die PolyA-Anreicherung nicht bevorzugt wird), lncRNAs, kleine RNAs und andere nicht-kodierende RNAs.

Wann sollte man rRNA-Depletion verwenden?

• Umfassende Transkriptomanalyse: Wenn Ihr Ziel darin besteht, alle Arten von RNA zu untersuchen, einschließlich nicht-kodierender RNAs (wie lncRNAs und miRNAs), kleiner RNAs oder sogar nicht-polyadenylierter mRNAs, ist die rRNA-Depletion eine bessere Option, da sie diese RNA-Typen bewahrt.
• Prokaryotische Proben: In Prokaryoten (die rRNA als die häufigste RNA haben) wird die rRNA-Depletion häufig verwendet, um die Qualität der RNA-Seq-Daten zu verbessern, da prokaryotische mRNAs keine PolyA-Schwänze haben.

Einschränkungen:

• Teilweise rRNA-Entfernung: In einigen Fällen entfernen rRNA-Depletionsmethoden möglicherweise nicht alle rRNA-Spezies, sodass einige Restmengen verbleiben.

Überlegungen für minderwertige RNA (rRNA-Depletion)

• Schwere RNA-Degradation: Die rRNA-Depletion eignet sich besser für minderwertige oder degradierte RNA, z.B. RNA, die aus FFPE-Schnitten extrahiert wurde, da sie nicht auf die Integrität der PolyA-Schwänze angewiesen ist. Auch bei fragmentierter RNA kann die rRNA-Depletion die rRNA-Kontamination effektiv reduzieren.

Zusammenfassung:

• PolyA-Anreicherung ist optimal, wenn Sie sich auf mRNA konzentrieren und die RNA-Qualität hoch bis moderat ist. Sie ist weniger effektiv, wenn die RNA degradiert ist oder wenn Sie nicht-polyadenylierte RNAs analysieren müssen.
• rRNA-Depletion funktioniert gut für alle nicht-rRNA-Typen und prokaryotische mRNA, insbesondere wenn Sie ein breiteres Spektrum von RNA erfassen möchten, einschließlich nicht-polyadenylierter RNAs wie lncRNAs. Diese Methode ist auch ideal, wenn Sie mit stark degradierter RNA arbeiten.