Die gewünschte Sequenz, welche beispielsweise für ein künstliches Protein kodiert, wird in eine Reihe von überlappenden Oligonukleotiden unterteilt. Um das bestmögliche Ergebnis zu erzielen, sollte die Sequenz der zu assemblierenden Oligonukleotide sorgfältig unter Einhaltung folgender Gesichtspunkte gewählt werden:
- die Bildung von Hairpin-Strukturen innerhalb der Oligonukleotide sollte vermieden werden
- wenn hohe Expressionsraten erwünscht sind (beispielsweise für die Protein-Produktion) sollten Sequenzen vermieden werden, die seltene Codons in ein Gen einführen
- Oligonukleotide mit eindeutigen Restriktionsschnittstellen können für anschließende Manipulationen durch rekombinante DNA-Techniken von Vorteil sein.
Eurofins Genomics verwendet die urheberrechtlich geschütze Software GENEius für das Design der Oligonukleotide.